送检猫三联抗体（中和试验法）或狂犬抗体（ELISA法）检测样品时，是否曾因“样品不合格”而困惑？这不仅延误检测进程，更可能影响对动物免疫状态的准确评估。本文将从科学角度解析为何必须使用合格血清，帮助您规避常见问题。
核心原则：抗体检测仅接受血清样品
根据WOAH（原OIE）《陆生动物诊断试验与疫苗手册》和《中国兽药典》检测要求，无论是检测猫三联抗体的中和试验，还是检测狂犬抗体的ELISA法，检测样品均须使用合格的血清。使用全血或血浆作为样品，会导致检测无法进行或结果严重失真。
全血 vs 血浆 vs 血清，有何不同？
全血：直接从动物血管中采集、未经处理的血液称为全血，包含血细胞和血浆；
血浆：如果全血中加入抗凝剂（如EDTA、柠檬酸钠、肝素），后经离心去掉血细胞，得到的淡黄色液体称为血浆。包含凝血因子、纤维蛋白原、抗凝剂等；
血清：如果让全血自然凝固，后经离心去掉血凝块，得到的上清液就是血清。
关键差异：血清不含纤维蛋白原和大部分凝血因子，也没有额外添加的抗凝剂，这正是抗体检测所必需的纯净环境。
（图片来源于网络）
为什么血浆和全血不可作为抗体检测的样品？
血浆中的抗凝剂对检测的影响
中和试验（猫三联）：此实验的核心在于样品中的抗体能否“中和”活病毒。血浆中添加的抗凝剂，会干扰病毒与抗体的特异性结合，甚至直接影响病毒的活性或细胞的健康状态，导致实验结果严重偏差或无效。
ELISA（狂犬）：ELISA依赖于抗原-抗体的特异性结合反应。如试剂盒使用辣根过氧化物酶作为标记酶，肝素会有影响检测结果；有研究表明，EDTA 抗凝的血液样品总体OD值高于血清样品，对 ELISA 检测结果产生正向干扰；抗凝剂还可能非特异性地结合到反应板上，造成背景干扰。
血浆中纤维蛋白原对检测的影响
血浆中富含纤维蛋白原。在ELISA检测过程中，纤维蛋白原很容易聚集成细小的纤维蛋白凝块。这些凝块会：
堵塞加样枪头或加样孔，导致加样量不准。
包裹住抗体，阻止其与板子上的抗原结合，造成假阴性。
在孔内形成不均匀的沉淀，影响最终显色的均一性和读数的准确性。
全血对检测的影响
1.严重溶血风险：全血在运输、离心过程中，红细胞极易破裂（溶血），释放出血红蛋白和细胞内物质。
中和试验：溶血释放的物质具有细胞毒性，能直接杀死实验用的敏感细胞，实验无法进行。
ELISA：血红蛋白有颜色（红色/棕色），会严重干扰光学读数（尤其是ELISA常用的450nm波长），造成假阳性或假阴性。溶血释放的细胞内酶也可能干扰ELISA的酶促反应。
2.含有大量干扰物：除了溶血产物，血细胞本身含有无数的酶、脂类等，都对实验结果造成干扰。
（图片来源于网络）
为什么对血清量也有要求？
如中和试验要求送检测血清样品量需达到0.8-1mL，主要原因有以下几点：
1.实验需求：无论是中和试验还是ELISA，都需要消耗一定体积的血清来完成检测流程，包括必要的重复孔或稀释步骤（尤其是中和试验需要做系列稀释）。
2.质控与复检需求：实验室需要进行内部质控，遇到可疑或临界结果时可能需要复测确认。样品量不足，无法完成复检。
3.操作损耗：移液过程中，不可避免会有少量血清粘附在管壁或枪头上，需预留损耗量。
如何成功获取一份合格血清？（避免溶血是核心）
溶血是导致血清样品不合格的最常见原因，避免溶血要注意以下要点：
1.选择合适的采血管：务必使用干燥、洁净的血清分离管（通常为红头）。不可使用含抗凝剂的采血管（如紫头/EDTA、蓝头/柠檬酸钠、绿头/肝素）。
2.规范采血操作：使用合适型号的针头，确保穿刺顺利。抽血时负压适中，避免过度抽吸。采血后，不要剧烈摇晃，静置时竖直倾斜放置，促进血液凝固。
3.确保血液完全凝固：无论是室温条件下还是低温条件下，均需静置等待血液样品充分凝固后，再进行离心操作，确保血液完全凝固。如果未完全凝固就离心，会形成纤维蛋白丝或凝块。
4.离心是关键：通常设置转速3000-4000rpm/min，离心5-10 分钟，即可获得较为纯净的血清。转速太低或时间太短，血细胞分离不彻底，血清量少且易混入细胞。
5.小心移取血清：用移液器小心吸取上层的血清转移到标记清晰的无菌管中。需避免触碰到下层的血细胞层。
6.储存与运输：分离出的血清应尽快检测。如需保存或运输，请置于-20°C或更低温度冷冻（避免反复冻融！）。运输时必须确保全程冷冻状态。
总结：样品不合格，对实验结果的影响！
使用血浆：抗凝剂和纤维蛋白原干扰检测，结果不可信。
使用全血：极易发生溶血或存在大量干扰物，检测根本无法进行。
样品严重溶血：检测无法进行或结果无效。
血清量不足：可能无法完成检测或复检，导致无法出具报告。
血清未完全分离/污染：将直接影响检测的准确性和可靠性。
一份合格的血清样品，是获得准确可靠的猫三联、狂犬疫苗抗体检测结果的基石！严格遵循“使用血清分离管、规范采血、确保血液完全凝固、充分离心、足量清亮血清、冷冻保存运输”这六大要点，就能最大程度避免“样品不合格”。
参考文献：
[1]. 2023World Organization for Animal Health (WOAH). Chapter 3.1.19. Rabies (infection with Virus and Other Lyssaviruses). In Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals.Paris,France.
[2]. 国家药典委员会. 中华人民共和国兽药典: 三部 [S]. 2020年版. 北京: 中国农业出版社, 2020: 通则3406。
[3]. 全国体外诊断网CAIVD. 免疫学检测的干扰因素和处理策略专家共识[Z].全国体外诊断网CAIVD微信公众号。
[4]. 医学检验废品加工车间. 抗凝剂对免疫学方法检测的影响及原理解析 [EB/OL].医学检验废品加工车间微信公众号。
